研究中一般用到均是现成的细胞系/株，我们只需要：进行细胞传代和保种。然而，这些细胞系常常由于体外长期培养，而丢失原有生物学特性，对药物处理的反应差距越来越大。因此，越来越多的人选择原代细胞。

1、什么是原代细胞培养?

原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进行培养的细胞。

组织主要指：

组织器官、外周血及胚胎等。由于原代细胞生长缓慢，繁殖一定的代数停止生长（一般10代以内）。

2、原代细胞分离培养的思路

取材--分离--培养--鉴定

首先将组织从机体中取出，经胰蛋白酶/胶原酶处理后分散成单细胞，再在合适的二氧化碳培养箱内的培养基中培养，使细胞繁殖到一定系数后进行细胞鉴定。

3、实验步骤

取7-10d雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

在超净工作台中，将大鼠断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑,放在盛有预冷的PBS玻璃培养皿中，去除小脑和间脑。

将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以去除软脑膜和脑膜大血管，再放在新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中。

用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。

大脑皮质放于DMEM中(含庆大霉素和谷氨酰胺 )，剪碎成约1mm3大小，放入50ml的离心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型胶原酶，0 .025-0 .05％IV型胶原酶，200-400U DNaseI)，混匀后37℃水浴消化1-1.5h。

室温1 000×g离心8min，去上清液。

沉淀中加入20％BSA重悬浮，充分混匀，1 000×g，20min，4℃离心，去上清。

沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的胶原酶/分散酶，0.05-0.1％I型胶原酶，100-300U DNaseI )重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室温离心6min，去上清液。

沉淀加入2ml DMEM(含庆大霉素和谷氨酰胺)培养液悬浮混匀，铺于经离心形成连续梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min。

靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后DMEM

漂洗两次(离心1000×rpm，6min，室温)，去上清液。

加入DMEM完全培养液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重悬浮，接种于含5％的大鼠 血清37℃孵育过夜所制备的细胞培养皿中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱内静置培养24h后更换不含嘌呤霉素的混合培养基，随后隔天换液。