怎么用恒温培养箱进行初代细胞培养？
2023-06-20 13:48 0次
细胞初代培养或原代培养，是从供体获取组织后的首次培养。其优点是：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大的变化，具有二倍体遗传性状，在供体来源充分、生物条件稳定的情况下（年龄、性别），在一定程度上能反映体内状态， 用于细胞培养的理想设备就是恒温培养箱，恒温培养箱主要用于发酵以及菌类培养等恒温试验，是生物遗传工程、医药、农、林、环境科学、兽牧、水产等生产、科研、教育部门不可缺少的实验室设备。
实验方法原理：
合成培养基胰蛋白酶消化培养法，能把组织块分散成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物，细胞能较快地长成单层。
本法尤适用于培养大量组织，细胞产量高；但用于经常性小量培养工作稍显繁琐，无菌操作不良时且易污染。
实验材料：试剂、试剂盒 Hanks、培养液、胰蛋白酶、仪器、耗材：吸管、平皿、培养瓶、烧杯、搅拌器、三角烧瓶、不锈钢筛、眼科剪、眼科镊、计数板
实验步骤：
1. 准备
取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20 分钟；
2. 布局
点燃酒精灯（或煤气灯），安装吸管帽（应通过火焰）；
3. 处理组织
把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60 分钟；
4. 剪切
用眼科剪把组织块切成2~3 毫米大小的块（用手术刀割亦可），以便于消化；加入比组织块总量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；
5. 消化
置入37 ℃恒温培养箱消化均可，消化中每隔20 分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好（消化前瓶中需置一无菌搅棒）；消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定；
6. 分离
在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块（必要时可继续进行消化）；低速（500~1000 转/分）离心消化液5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脱一两次后，再加入培养液）；
7. 计数
用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数细胞来说，pH 要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说胆液体变酸，可用NaHCO3调整；
8. 培养
置入36.5 ℃恒温培养箱，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。
注意事项：
组织块、胰蛋白酶、培养液等易受紫外线伤害的物品，在培养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线影响；开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部（工作时宜挽上袖口）。 (责任编辑：admin)
实验方法原理：
合成培养基胰蛋白酶消化培养法，能把组织块分散成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物，细胞能较快地长成单层。
本法尤适用于培养大量组织，细胞产量高；但用于经常性小量培养工作稍显繁琐，无菌操作不良时且易污染。
实验材料：试剂、试剂盒 Hanks、培养液、胰蛋白酶、仪器、耗材：吸管、平皿、培养瓶、烧杯、搅拌器、三角烧瓶、不锈钢筛、眼科剪、眼科镊、计数板
实验步骤：
1. 准备
取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20 分钟；
2. 布局
点燃酒精灯（或煤气灯），安装吸管帽（应通过火焰）；
3. 处理组织
把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60 分钟；
4. 剪切
用眼科剪把组织块切成2~3 毫米大小的块（用手术刀割亦可），以便于消化；加入比组织块总量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；
5. 消化
置入37 ℃恒温培养箱消化均可，消化中每隔20 分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好（消化前瓶中需置一无菌搅棒）；消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定；
6. 分离
在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块（必要时可继续进行消化）；低速（500~1000 转/分）离心消化液5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脱一两次后，再加入培养液）；
7. 计数
用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数细胞来说，pH 要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说胆液体变酸，可用NaHCO3调整；
8. 培养
置入36.5 ℃恒温培养箱，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。
注意事项：
组织块、胰蛋白酶、培养液等易受紫外线伤害的物品，在培养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线影响；开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部（工作时宜挽上袖口）。 (责任编辑：admin)
